بیان فراوان و خالص سازی بخشی آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز از باکتری pyrococcus furiosus

واکنش زنجیره های پلیمراز که معمولا به اختصار pcr خوانده می شود، روشی بسیار قدرتمند در تکثیر ردیف منخبی از نوکلئوتیدهای قطعات dna است. انجام این واکنش همانند سازی به فعالیت آنزیم های پلیمرزا وابسته است که مقاومت به گرما در این آنزیم ها از مهم ترین خصوصیات آن ها محسوب می شود. در واقع پس از کشف و کاربرد آنزیم های پلیمرزا مقاوم به حرارت بود که pcr به یک روش رایج در آزمایشگاه ها تبدیل شد. علاوه بر این خصوصیت، آنزیم های پلیمراز مورد استفاده از نظر نرخ اشتباه نیز با هم متفاوتند. آنزیم pfu پلیمراز جداشده از باکتری گرمادوست pyrococcus furiosus یکی از مهم ترین آنزیم های مورد استفاده در pcr است که به دلیل داشتن خاصیت اگزونوکلنازی 5-3 یا پردازشکری، کمترین نرخ خطا را در میان آنزیم های پلیمراز شناخته شده دارد. در تحقیق حاضر امکان افزایش تولید این آنزیم با سیستم بیانی pet در باکتری ٍ escherichia coli موردمطالعه قرار گرفت. برای رسیدن به این هدف سه ساختار متفاوت از ژن کد کننده ای pfu پلیمراز به این شرح تهیه گردیدند: 1- pfu منفرد (آنزیم پلیمراز بدون تغییر، در وکتور بیانی2- pet + 2lc-)، ubi-pfu آنزیم پلیمراز با پروتئین یویی کوئیتین در بالادست آن به عنوان شریک الحاق، در وکتئر بیانی و 3- pelb-ppfu (آنزیم پلیمراز با پپتید pelb در بالا دست آن به عنوان شریک الحاق در وکتود بیانی pet-2lc، ساختارهای طراحی شده با نژاد bl21 باکتری e.coli انتقال یافتند. که پس از رشد در محیط مایع tb با iptg تیمار گردیدند. تولید پروتئین های مورد نظر با استفاده از الکتروفورز روی ژل پلی اکریلامید سدیم دودسیل سولفات (sds-page) مورد تایید قرار گرفت، مقایسه ی بین میران پروتئین هار نوترکیب نشان داد که بیان ubi-pfu در حد pfu منفرد و pelb-pfu حدود چهار تا پنج برابر pfu منفرد بوده است. فعالیت بیولوژیکی آنزیم ها نیز با بررسی توانایی آن ها در تکثیر قطعات dna در واکنش های pcr مورد بررسی قرار گرفت و مشخص گردید دهر سه آنزیم تولید شده دارای فعالیت بیولوژیکی مورد انتظار می باشند. فعالیت آنزیمی puf منفرد و ubi-pfu مشابه ولی فعالیت pelb-pfu بطور قابل ملاحظه ای پیش از دو آنزیم دیگر بود. البته بطور معمول وجود پپتید pelb در بالادست پروتئین های تراریختی در کولی باسیل نه تنها موجب افزایش بیان آن ها می شود بلکه موجب ترشح آن ها به فضای بین غشائی (periplasmic space) نیز می گرددو لذا انتظار می رفت که pelb-pfu بر خلاف pfu منفرد و ubi-pfu ، از میتوپلاسم باکتری خارج شده و در فضای بین غشائی تجمع یابد. دو روش شوک اسمزی و تیمار حرارتی 55c که بطور معمول برای استخراج پروتئین ها از فضای بین غشای باکتری e.coli بکار می روند. در استخراج pelb-pfu موفقیت آمیز نبودند. البته مشخص نشد که آیا علت این پدیده عدم ترشح pelb-pfu به فضای بین غشائی است یا آنکه pelb-pfu به فضای بین غشائی ترشح می گردد اما به علت اندازه ی بزرگ قادر به خروج از غشاء خارجی باکتری نیست.